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详解高速冷冻离心机提取植物蛋白质方法
日期：2024-12-03 01:45
浏览次数：1778
摘要：一、植物安排蛋白质提取办法
1、依据样品分量(1g样品参加3.5ml提取液，可依据材料不同恰当参加)，准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵顶用液氮研磨，研磨后参加提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用冷冻离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，样品制备完毕。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
这种办法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
二、植物安排蛋白质提取办法
氯醋酸—丙酮堆积法
1、在液...
一、植物安排蛋白质提取办法
1、依据样品分量(1g样品参加3.5ml提取液，可依据材料不同恰当参加)，准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵顶用液氮研磨，研磨后参加提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用冷冻离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，样品制备完毕。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
这种办法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
二、植物安排蛋白质提取办法
氯醋酸—丙酮堆积法
1、在液氮中研磨叶片
2、参加样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
3、参加等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空枯燥堆积，备用。
4、上样前参加裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有堆积为标准)，可暂时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3mlmie菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再参加1M的DTT65ul/ml。
这种办法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特色！当然单向电泳也相同适用，只是电泳的条带会削减！
三、安排：肠黏膜
目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达
使用TRIPURE提取蛋白质进程：
含蛋白质上清液中参加异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
倒转混匀，置室温10min
离心：12000g，10min，4度，弃上清
参加0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)
振荡，置室温20min
离心：7500g，5min，4度，弃上清
重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次
堆积中参加100％乙醇2ml
充分振荡混匀，置室温20min
离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干堆积
1％SDS溶解堆积
离心：10000g，10min，4度
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)
存在的问题：参加1％SDS后堆积不溶解，仍是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。
处理：提蛋白试剂盒，别的安排大小适中，要碎，当即加2XBUFFER，然后煮5－10分钟，作用很好的。
四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重复离心5min
lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的办法进行。
100mg材料剪碎后参加10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，参加1.5ml10%三***(丙酮制造，含10mM即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃堆积1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，堆积复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃堆积1小时，同上离心弃上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得堆积低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉参加20μl(可调)UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃温育30min，期间搅动几回，28度(温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或许-70度保存
六、植物根中蛋白质的抽取
(1)sample,液氮研磨
(2)装1.5mlcentrifuge用tube
(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul
(4)12000rpm,4度,10-15minite
(5)取上层液，蛋白质就在里边
1、依据样品分量(1g样品参加3.5ml提取液，可依据材料不同恰当参加)，准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵顶用液氮研磨，研磨后参加提取液中在冰上静置(3-4小时)。
3、用冷冻离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，样品制备完毕。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
这种办法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！
二、植物安排蛋白质提取办法
氯醋酸—丙酮堆积法
1、在液氮中研磨叶片
2、参加样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
3、参加等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空枯燥堆积，备用。
4、上样前参加裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有堆积为标准)，可暂时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3mlmie菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再参加1M的DTT65ul/ml。
这种办法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特色！当然单向电泳也相同适用，只是电泳的条带会削减！
三、安排：肠黏膜
目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达
使用TRIPURE提取蛋白质进程：
含蛋白质上清液中参加异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
倒转混匀，置室温10min
离心：12000g，10min，4度，弃上清
参加0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)
振荡，置室温20min
离心：7500g，5min，4度，弃上清
重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次
堆积中参加100％乙醇2ml
充分振荡混匀，置室温20min
离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干堆积
1％SDS溶解堆积
离心：10000g，10min，4度
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)
存在的问题：参加1％SDS后堆积不溶解，仍是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。
处理：提蛋白试剂盒，别的安排大小适中，要碎，当即加2XBUFFER，然后煮5－10分钟，作用很好的。
四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
1、200毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重复离心5min
lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的办法进行。
100mg材料剪碎后参加10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，参加1.5ml10%三***(丙酮制造，含10mM即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃堆积1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，堆积复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃堆积1小时，同上离心弃上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得堆积低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉参加20μl(可调)UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃温育30min，期间搅动几回，28度(温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或许-70度保存
六、植物根中蛋白质的抽取
(1)sample,液氮研磨
(2)装1.5mlcentrifuge用tube
(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul
(4)12000rpm,4度,10-15minite
(5)取上层液，蛋白质就在里边
